Gli infiniti campi d’applicazione di CRISPR

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di Riccardo Rocchi, laureato in Comunicazione scientifica biomedica, Sapienza Università di Roma

La tecnologia CRISPR si è fatta conoscere come uno strumento dalle grandi potenzialità nel campo dell’ingegneria genetica. Il moltiplicarsi degli studi e delle pubblicazioni scientifiche è coinciso con lo sviluppo di varianti, dagli impieghi più disparati.
Malattie genetiche come la fibrosi cistica, la Corea di Huntington e l’emofilia sono accomunate, oltre dal non avere una cura definitiva, da una origine simile. Si tratta di mutazioni puntiformi, cioè di un singolo nucleotide (o base), che compromettono un intero gene.

 Tra gli innovativi enzimi Cas, cuore della tecnologia CRISPR, si aggiunge la nickasi Cas9, un mutante della tradizionale Cas9 che può rivoluzionare il trattamento di tutte le patologie dovute a mutazioni puntiformi. La nickasi Cas9 è in grado di generare un nick del DNA, cioè una rottura del legame fosfodiestere tra nucleotidi adiacenti, piuttosto che un taglio del doppio filamento (DSB). Può essere impiegata sempre per compiere dei tagli, di maggiore precisione, oppure per la correzione di singole basi, strumento che in questo caso prenderà il nome di editor di base. [1]

Per via della specificità, CRISPR può anche essere impiegata come un amo o come vettore di precisione. Inibendo la funzione di taglio (Cas inattivi o dCas) ed equipaggiando il complesso con repressori o attivatori trascrizionali è possibile agire a livello delle sequenze regolatorie dei geni per modulare la loro espressione (interferenza ed attivazione CRISPR).

Utilizzando la tecnologia in questo modo, per trattare ad esempio patologie metaboliche causate dalla sovra espressione di una proteina o dalla sua totale mancanza, si sopperisce alle problematiche legati ai tagli indotti con una Cas9 tradizionale. Il processo è inoltre facilmente reversibile: non si rimuove il gene che può quindi tornare funzionare fisiologicamente all’occorrenza[2].

Nel settore diagnostico CRISPR si propone di rimpiazzare totalmente la tradizionale PCR (Proteina C-Reattiva). Le più piccole Cas14 vengono coniugate con una “molecola-segnale”, quando c’è appaiamento e taglio, segue la scissione della molecola che porta alla segnalazione di positività o negatività.

Sono stati sviluppati in questo modo test per rilevare la presenza di Sars-CoV2 ed altri virus, ovviamente la metodologia è applicabile a qualsiasi malattia infettiva e non solo. Identificare mRNA può voler dire acquisire informazioni su ambienti tumorali o identificare altri stati patologici, come il rigetto in pazienti che erano stati sottoposti a trapianto renale che manifestavano un’aumentata concentrazione del biomarcatore CXCL9 mRNA.

Si parla di diagnostica anche con l’imaging CRISPR. Utilizzando dCas9 cataliticamente inattivo fuso con un marcatore fluorescente, è stato ottenuto un etichettatore di DNA personalizzabile, compatibile con la microscopia a fluorescenza largamente impiegata nelle cellule viventi. Con dCas9 etichettati con diverse proteine ​​fluorescenti è possibile un imaging multicolore per il monitoraggio simultaneo di più loci genomici. Allo stesso modo, con dCas13 vi è la possibilità di marcare e seguire RNA, strumento decisamente utile per lo studio dei profili metabolici.   

Applicazioni pressoché infinite capaci di permeare ogni settore delle Life Science e, soprattutto, di dare speranza ai pazienti spesso vittime della rassegnazione.

References

  1. AddGene. (n.d.). CRISPR Guide. addgene.org. https://www.addgene.org/guides/crispr/
  2. AddGene. (n.d.). CRISPR History and Development for Genome Engineering. addgene.org. https://www.addgene.org/crispr/history/
  3. Kaminski, M. M., Riella, L. V., Collins, J. J., & al., E. (2020). A CRISPR-based assay for the detection of opportunistic infections post-transplantation and for the monitoring of transplant rejection. Nature Biomedical Engineering, 4, 601–609. https://www.nature.com/articles/s41551-020-0546-5
  4. Kantor, A., McClements, M. E., & MacLaren, R. E. (2020). CRISPR-Cas9 DNA Base-Editing e Prime-Editing. International Journal of Molecular Sciences, 21(17), 6240. https://www.mdpi.com/1422-0067/21/17/6240/htm
  5. Mammoth Biosciences. (n.d.). The CRISPR-based detection platform. mammoth.bio. https://mammoth.bio/diagnostics/
  6. Yang, L.-Z., Wang, Y., & al., E. (2019). Dynamic Imaging of RNA in Living Cells by CRISPR-Cas13 Systems. Molecular Cell, 76(6), 981-997. https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(19)30802-0?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS1097276519308020%3Fshowall%3Dtrue

[1] Essi vengono creati fondendo nickasi Cas9 ad ulteriori enzimi: una citidina deaminasi, editor di base di citosina (CBE); una adenina deaminasi, editor di base di adenina (ABE). L’enzima citidina deaminasi crea una mutazione specifica, convertendo una coppia di basi azotata C:G (citosina e guanina) in T:A (timidina e adenina). L’enzima adenina deaminasi compie invece il cambiamento nella direzione opposta.

[2] I Cas inattivi possono essere fusi anche con modificatori epigenetici come p300, LSD1, MQ1 e TET1 per creare strumenti programmabili di ingegneria dell’epigenoma. In modo analogo a quello descritto in precedenza si riesce a regolare l’espressione di geni, agendo però su un altro livello di regolazione.

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